Desarrollo, estandarización y aplicación de la técnica molecular PCR en tiempo real para la detección y cuantificación de ADN del trematodo Amphimerus spp en metacercarias obtenidas de peces

Abstract:

La Organización Mundial de la Salud (OMS) considera a las trematodiasis como enfermedades tropicales olvidadas. En el Ecuador existen 3 trematodiasis que son prevalentes persistentes en zonas tropicales, paragonimiasis, fasciolasis y amphimeriasis. La amphimeriasis que fue recientemente y por primera vez descrita en Ecuador, es considerada una enfermedad emergente, infectando personas, gatos y perros en las provincias de Esmeraldas y Manabí. Amphimerus spp. se localiza aloja en las vías biliares de los infectados causando enfermedad. El ciclo de vida de Amphimerus requiere de 2 hospederos intermediarios; los primeros son invertebrados (caracoles de río) mientras que los segundos son varias especies de peces de agua dulce. La infección se produce por la ingestión de peces crudos o mal cocidos infectados con metacercarias del parásito. La identificación de las metacercarias en los peces se realiza por disección, digestión artificial y observación microscópica; sin embargo, la sensibilidad, especificidad y eficiencia se ven afectadas por esta técnica laboriosa. Por esta razón, se requiere del desarrollo de técnicas moleculares como la PCR en tiempo real (qPCR) para la identificación rápida y específica de ADN del Amphimerus en diferentes especies de peces en las zonas endémicas. En esta investigación se estandarizó una PCR en Tiempo Real usando cebadores diseñados in house dirigidas a la región ITS2 de Amphimerus, se estandarizó por medio de gradientes de temperatura de hibridación y denaturación; y variaciones en la concentración de cebadores. En el ciclo de umbral (Ct) resultante de cada variación no se encontró diferencias estadísticamente significativas; sin embargo, los parámetros seleccionados fueron los que contenían un menor Ct debido al mayor porcentaje de sensibilidad. Las curvas de calibrado obtenidas mantuvieron una eficiencia mayor al 90 por ciento y coeficiente de correlación (R2) mayor al 0.98, indicando que el nivel de confiabilidad de la técnica realizada es alto. La técnica identifica 1 metacercaria y concentración de ADN de 0,05 ng-μl. La especificidad se determinó comparando ADN de dos trematodos Paragonimus y Fasciola encontrando que los cebadores fueron específicos para Amphimerus. En experimentos con músculo de pez infectado se determinó que el peso o la cantidad de músculo afectan la detección ADN de Amphimerus. En conclusión, la técnica desarrollada de PCR en Tiempo Real demostró ser altamente sensitiva, específica y confiable en la detección del trematodo Amphimerus spp. En estado de metacercaria encontrados en peces. Esta técnica podría aplicarse para diferenciar las especies de peces portadoras del parasito, para así educar a las personas en riesgo en la prevención de la infección y tomar medidas de control/eliminación efectivas en la comunidad.

Año de publicación:

2019

Keywords:

• Enfermedades Infecciosas
• BIOTECNOLOGÍA
• PRUEBAS DE ADN
• PECES

Fuente:

rraae