Detección y cuantificación por qPCR del ADN microbiano total en muestras de bilis humanas como paso previo a estudios del microbioma biliar

Abstract:

En los últimos años se está poniendo de manifiesto más claramente la relación entre el metabolismo de sales biliares y el colesterol y la microbiota del tracto gastrointestinal (TGI), así como sus posibles implicaciones en la salud. A diferencia de otras localizaciones del TGI, el microbioma de la bilis y el tracto biliar apenas han sido estudiados, debido principalmente a la limitación para acceder al material biológico y la dificultad de obtener ADN de calidad entre otros. En este trabajo se ha optimizado un protocolo de extracción y purificación de ADN total de bilis humana, y se ha desarrollado un método de discriminación y cuantificación de ADN microbiano basado en PCR cuantitativa (qPCR), para seleccionar aquellas muestras de bilis con mayor carga microbiana con el objetivo de caracterizar el microbioma biliar mediante ultrasecuenciación del ADN total y realizar un análisis metagenómico funcional. Se extrajo el ADN de muestras de 1ml de bilis, de 22 sujetos sanos y 12 pacientes con colelitiasis. El método se basó en el descrito por Moles y cols. (2013) con ligeras modificaciones. Para la discriminación del ADN microbiano y eucariota el ADN total extraído se cuantificó por qPCR utilizando cebadores universales para el gen del ARNr 16S y el gen del ARNr 18S, utilizando rectas patrón a partir de la cepa Lactococcus lactis NZ9000 y de la línea celular HT-29. Por otro lado, se enriquecieron muestras de bilis con diluciones decimales de concentración conocida de L. lactis NZ9000 (rango 108-103 ufc/ml) para determinar la eficiencia del método y testar el efecto matriz. El enriquecimiento con la cepa de L. lactis de las muestras de bilis …

Año de publicación:

2016

Keywords:

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