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Estratégias de transfecção plasmideal em linhagem eritroleucêmica K562

Abstract:

A linhagem celular K562 é derivada de uma paciente acometidos por leucemia mielóide crônica (LMC). Essas células caracterizam-se pela presença do cromossomo Philadelphia correspondente a translocação t (9; 22) gerando uma proteína quimérica (BCR-ABL) com atividade constitutiva de tirosina quinase. Essa linhagem pode ser também empregada em estudos de eritropoiese, na avaliação de outros genes envolvidos na LMC e em estudos de novas abordagens terapêuticas, in vitro, envolvendo a LMC. A eletroporação tem se destacado como um método promissor para transferência gênica, induzindo a permeabilização da membrana celular, através do emprego de um pulso elétrico, permitindo a entrada de moléculas exógenas. Os parâmetros exigidos para o melhor emprego dessa técnica são altamente variáveis, sendo então necessário que se leve em consideração diversos fatores. Dentro desse contexto, empregando a linhagem celular K562, temos como objetivo a otimização de um protocolo de eletroporação de células eucarióticas, visando a eficiente transferência de DNA (pEGFP-N1), com a mínima morte celular. Nesse estudo, células K562 [1x107células/ml] foram eletroporadas sobre diferente condições de voltagem, capacitância e resistência, além de serem centrifugadas, para formação de precipitado, a fim de aumentar a viabilidade. A avaliação da viabilidade celular tanto antes quanto após o pulso foi realizada empregando teste de exclusão por azul tripan. A eficiência de transfecção foi observada 48hs após eletroporação, sendo as células analisadas através de citometria de fluxo quanto à expressão da …