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Identificación y clonación de secuencias codificantes de peroxidasas de granos inmaduros de fréjol (Phaseolus vulgaris)

Abstract:

Las peroxidasas son hemoproteínas cuya actividad catalítica se utiliza en pruebas de diagnóstico, desarrollo de biosensores y biorremediación, las más utilizadas son la peroxidasa de rábano picante (Armoracia rusticana) o HRP y la peroxidasa de soja (Glycine max) o SBP. Actualmente estas enzimas tienen un alto costo, por lo que es necesario buscar alternativas que permitan obtenerlas y disponer de manera inmediata en el país para su aplicación en el desarrollo de herramientas de diagnóstico. En la búsqueda de alternativas a las peroxidasas comerciales, se realizó una revisión de la literatura para identificar secuencias de SBP previamente descritas, las secuencias localizadas se utilizaron para identificar secuencias codificantes ortólogas en fréjol (Phaseolus vulgaris), con las secuencias identificadas se diseñaron oligonucleótidos para la generación y amplificación de los ADNc respectivos. Después de obtener el ARN total de la cutícula de granos inmaduros, se llevó a cabo la síntesis del ADNc y la generación de productos de PCR. Los resultados de la secuenciación de los productos de PCR mostraron que ha sido posible obtener secuencias que codifican peroxidasas ortólogas de Ep (NP_001238315.1, NM_001251386 .1) y Prx2 (NP_001237601.1, NM_001250672.2) a partir de fréjol. Las secuencias obtenidas en este trabajo tienen una alta identidad con las secuencias reportadas en P. Vulgaris, Ep (PHAVU_006G129900g) con 99.08% y 99.69% para Prx2 (PHAVU_003G078600g). Las secuencias codificantes de peroxidasas clonadas en el vector pET15b fueron inducidas en la cepa de Escherichia coli Origami (DE3) y el extracto de proteína total obtenido mostró actividad enzimática sobre los sustratos de peroxidasas 3,3′-diaminobencidina, 4- cloro-1-naftol y siringaldazina. Finalmente, los resultados obtenidos permiten concluir que fue posible obtener dos secuencias codificantes de proteínas con actividad peroxidasa a partir de Phaseolus vulgaris.