Purificación y caracterización de inhibidores de tripsina provenientes de semillas de amaranto, arveja, chocho, fréjol y sangorache, mediante cromatografía de afinidad

Abstract:

Las harinas de las semillas de amaranto, arveja, chocho, fréjol y sangorache se desengrasaron y se sometieron a un proceso de extracción, mediante su suspensión en solución tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, durante 1,5 h. Los extractos obtenidos se fraccionaron en permeados (<10 kDa) y retenidos (10-50 kDa), a través de membranas de ultracentrifugación, y se ensayó su capacidad inhibidora de tripsina. Se seleccionaron los extractos inhibidores más activos según la actividad inhibidora específica alcanzada, después de su purificación parcial por tratamiento calórico (T = 60 °C, t = 30 min) y precipitación de proteínas con TCA (5 %). Se eligieron el permeado y retenido de la semilla de sangorache con valores de actividad de 19,22 ± 0,40 y 39,88 ± 0,69 mU/mg, respectivamente. Estos extractos se purificaron por cromatografía de afinidad en una matriz de tripsina-glioxil-sepharosa 6B-CL. A partir del permeado se obtuvieron los lotes I, II y III, con actividades inhibidoras de 17,32; 762,80; y, 291,17 mU/mg, respectivamente. Simultáneamente, del retenido se tuvieron los lotes IV, V y VI, con actividades inhibidoras de 58,13; 1 024,24; y, 389,23 mU/mg, respectivamente. Luego, los seis lotes fueron liofilizados a -67 °C y un vacío de 10 Pa. Por espectrometría de masas MALDI-TOF, se encontraron los picos de mayor abundancia en 9 159,94 y 8 102,71 Da. Además, la caracterización cinética determinó la presencia de dos tipos de inhibidores; el inhibidor I correspondió a un inhibidor competitivo, con una constante de inhibición (Ki) de 0,066 mM, y el inhibidor II, con características de inhibición mixta, tuvo una Ki de 0,274 mM y una …

Año de publicación:

2014

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